近日，由中南大学生殖与干细胞工程研究所林戈教授与北京希望组生物科技有限公司（以下简称“希望组”）梁帆带领的团队在BioRxiv在线发表一篇题为《Localization of balanced chromosome translocation breakpoints by long-read sequencing on the Oxford Nanopore platform》的研究成果。该研究利用Oxford Nanopore测序技术，从6个平衡易位携带者和1个倒位携带者中精准鉴定了断点的位置，证实了低覆盖度的全基因组长读长测序是易位断点精确定位的理想工具，并且可以提供关于断点SNPs的单倍型信息，可广泛应用于SVs检测、治疗监测、辅助生殖技术(ART)和胚胎植入前遗传诊断(PGD)。

基因组结构变异(SVs)，包括插入、缺失、重复、倒位和易位，通过重要功能基因的变异或剂量变化而导致人类遗传疾病的发生。染色体平衡易位，是一种常见的结构变异(SVs)类型，由染色体之间的片段交换引起的。而当单个染色体在自身内经历断裂和重排时，就会发生倒位。在大多数情况下，染色体核型的改变通常不会引起明显的遗传效应，这是由于尽管调控元件的改变可能会影响基因表达，但基因拷贝数并没有改变。 然而，在少数病例中，易位/倒位的断点会破坏基因结构，导致与各种疾病相关的基因功能丧失，从而引发不孕不育、疾病综合征和先天性异常等。例如，平衡易位携带者会在配子形成的过程中产生高比例的非整倍体异常配子，从而导致不孕、流产及胎儿异常。因此，准确定位易位断点对于提高辅助生殖的成功率具有重要意义。



在传统的检测技术中，染色体核型分析具有功能强大、性价比高等特点，可为不孕患者提供遗传咨询，是一种有价值的诊断工具。然而，该方法的低分辨率限制了它不能识别潜在的平衡易位，不能准确识别断点，因而不能推断出这些染色体异常带来的后果。



目前传统的鉴定易位断点的方法包括荧光原位杂交(FISH)、Southern blot 杂交、inverse-PCR和长片段PCR，但这些技术耗时、昂贵、也难以提供有关断点的SNPs信息。随着测序技术的进步，二代测序技术(NGS)为易位分析和断点检测提供了新的途径。然而，NGS由于测序读长较短无法准确检测复杂重复序列区域，使其在易位/倒位断点检测上有其固有的局限性。



近年来，纳米孔测序技术，作为一种单分子长读长测序技术，凭借其长读长(测序读长平均＞10 kb)、无GC偏好性等优势，即使在重复区域内也可以极大提高SVs的检出率，为易位断点的精准鉴定提供了一个理想的工具。此外，长读长测序还有助于解析易位断点和附近的SNPs或Indels之间的单倍型，这对植入前遗传学诊断(PGD)具有特别重要的意义。


染色体平衡易位和倒位携带者的染色体核型分析



本研究通过湘雅生殖与遗传医院共招募了7名患者，这些携带者患有长期不育或复发性流产，或染色体综合征。本研究首先通过标准流程对这些患者进行了G显带核型分析。结果显示，6个为平衡易位的携带者，1名为倒位携带者。

DNA提取和Nanopore测序



提取所有受试者的DNA，并使用Nanopore GridION X5进行测序。结果在每个样本中获得了32-44 Gb的测序数据，平均长度为12.3-16.3 Kb，深度为9.87-13.54X。



平衡易位检测和断点鉴定



通过希望组自主开发的生物信息学流程对获得的长读长测序数据进行了比对分析，确定7位易位/倒位携带者的断点的位置。例如，在样本DM17A2237中，有10条reads将断点定位在chr18:28685658，另外有10条reads将断点定位到chr21:29073597点。随后通过Sanger测序进行了断点验证，结果证实了与核型分析的结果一致。结果表明，通过长读长测序可精确确定平衡易位断点的位置。

在样本DM17A2236、DM17A2246、DM17A2247和DM17A2249中，断点分别位于CSMD3、AK129567、AK302545、RNF139和CCDC102B的内含子中。因此，这些断点破坏了基因结构，导致染色体之间的物质交换，从而破坏了基因的功能。对病例的进一步分析表明，核型的改变在携带者的早期并没有明显的表型影响，但几乎所有的携带者在成年后都有一种原发性不孕症的表型，这是由减数分裂异常引起的。



Alu元件引起的基因组重排可能会导致疾病的发生，如遗传性疾病、血液疾病和神经系统疾病。本研究发现，在样本DM17A2237中，chr18:28685658的断点发生在AluY元件中;在DM17A2250样品中，chr9:44216447的断点发生在AluSx3元件上。虽然这些断点没有破坏任何基因的结构，但它们可能仍然与这些患者的不孕有关。



大多数涉及到着丝粒的易位都是罗伯逊易位，涉及到着丝粒的染色体平衡易位，是一种罕见的类型，目前只在少数病例中有报道。本研究中DM17A2250的核型为46,XX,t(3;9)(p13;p13)，为染色体平衡易位携带者，但其3号染色体上的断点位置却位于近端着丝粒附近，长读长测序的结果也显示在chr3:90,504,854处有一个明显的断点，且与核型的结果一致，但它并不是典型的罗伯逊易位。

倒位检测和断点鉴定



与平衡易位相似，倒位不会改变染色体的拷贝数，并且很难被传统的短读长测序平台检测到。本研究成功地检测到在DM17A2248携带者中chr11:58,255,398-58,293,470和chr11:100,430,372-100,461,378发生了倒位。通过PCR和Sanger测序验证，最终将断点定位到chr11:58,265,643和chr11:100,448,937，且与核型结果一致，也进一步证实了长读长测序可用于倒位断点的检测。



Sanger测序断点验证



为了进一步验证易位断点位置和相邻的SNPs，随后进行了PCR扩增和Sanger测序，从而在单个碱基水平上分析断点序列。通过Sanger测序成功鉴定了样本DM17A2236、DM17A2237、DM17A2248和DM17A2249中的断点，但在DM17A2246、DM17A2247和DM17A2250中没有鉴定到。这由于DM17A2246和DM17A2247的断点位于高度重复的区域，DM17A2250的断点位于着丝粒附近，这些断点很难获得PCR产物。但值得注意的是，在样本DM17A2247中，研究人员成功地从正常染色体中获得了没有易位的目标PCR条带，但是在重组染色体上没有发现该条带，这表明在断点附近可能有一个缺失或更大片段的插入干扰了引物的结合位点。以上结果表明了长读长测序在准确检测易位断点的能力，而核型分析只能提供粗略的结果。

单倍型检测



染色体的单倍型鉴定对于植入前遗传学诊断(PGD)具有重要意义，可以利用相邻的SNPs信息来预测单个细胞中是否存在平衡易位。本研究使用断点作为marker进行单倍型分析。



通过这些marker，研究人员成功地发现了断点附近的SNPs，在低覆盖度（10X）下区分出了DM17A2237样品中的易位染色体和相应的正常同源染色体。当携带者的配偶有正常的核型时，单倍型分析将有助于PGD区分出具有平衡易位的胚胎和正常胚胎。以上结果表明，通过低覆盖长读长测序可以检测到单倍型，而通过增加测序深度可以得到更准确的单倍型信息。

研究结论

综上所述，与传统的方法如FISH和NGS相比，低覆盖率的全基因组长读长测序可以成为分析染色体易位的更有效工具。通过与核型和Sanger测序结果的比较，本研究证实了纳米孔测序具有较高的分辨率和准确性。因此，在未来的染色体易位分析和断点检测中，长读长测序可能会发挥更重要的作用，为生殖和植入前的遗传诊断提供有价值的帮助。